食品事業部の村瀬です。

弊社は、2024.5.22(水)～24(金)、東京ビッグサイトにて開催された
「ifia JAPAN 2024　第29回 国際食品素材／添加物展・会議」
(食品化学新聞社主催)に出展いたしました。
展示ブースにお越しいただいた皆様、誠にありがとうございました。

この記事では、展示期間中、皆様から頂戴したご質問の中から
特に多くいただいた内容をご紹介し、回答いたします。
ぜひ最後までご覧ください。

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Q：何ができる会社ですか？

A：お客様のご要望に応じて、新規酵素探索、酵素改変を行います。
従来の手法とは異なる、独自のバイオインフォマティクス技術を用いた
スピーディーな酵素開発によって、酵素メーカー、食品メーカー両者にとっての
イノベーションアクセラレーターになることができると考えています。

Q：具体事例はありますか？

A：ケミカル用途では、ユーザーが必要とする新規酵素の探索や、
酵素の大幅な活性向上に成功した事例がございます。
食品用途では、現在複数のお客様より具体的なテーマをいただき
実際にお取り組みさせていただいている状況です。

Q：digzyme Spotlight（酵素改変型プログラム）では、酵素の何の性質が改変できる？

A：活性向上、耐熱性向上、至適pHの改変などが考えられます。
基質特異性の改変は状況に応じて、digzyme Moonlight（酵素探索型プログラム）を使用します。

Q：どのような流れで開発を進める？

A：お客様の状況に応じて、スタートとゴールを設定させていただきますが
主な流れは以下となります。

1.開発コンサルティング：お客様の課題をヒアリングし、ターゲットとする酵素を選定します。

2.酵素デザイン：スーパーコンピューターを用いて、ターゲットとなる酵素のデザインをします。

3.酵素ライブラリ提供：コンピューター上でデザインした酵素を
実際に微生物を用いてラボスケールで製造し、目的に沿った酵素かを検証・確認します。

4.酵素の生産提供：製造スケールをラボからプラントへスケールアップし、
製品として酵素を安定供給できる体制を整備します。

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当記事でのQ &Aは以上です。
それでは、最後までご覧いただきありがとうございました。
その他のご質問などございましたら、下記のコンタクトフォームよりお問い合わせくださいませ。

【▼コンタクトフォーム】
https://www.digzyme.com/contact/

はじめに

事業開発部の礒崎です。弊社では酵素反応による原料から目的物までの人工的な合成ルート探索を行っています。目的物と原料の化合物構造データを入力するだけで、原料から目的物を合成する可能性のあるルート候補を出力します。本ブログでは、その具体例として高強度ポリマーの原材料となる化合物4-アミノ桂皮酸をグルコースから合成するルートを予測し、反応を担う酵素を予測した結果をご紹介します。

合成経路探索に使用した材料

Tateyama et al., 2016において、高強度のポリマーを生産するための原材料として4-アミノ桂皮酸を使用しています。この4-アミノ桂皮酸を合成するために使用された経路が図1です。グルコースを原料としてStreptomyces venezuelae 由来のAminodeoxychorismate synthase (PapA)とS. pristinaespiralis由来の Aminodeoxychorismate synthase (PapBC)を導入した大腸菌により4-アミノフェニルアラニンを生産させます。さらに、この4-アミノフェニルアラニンを原料としてRhodotorula glutinisのPhenylalanine ammonia-lyase (RgPAL)を導入した大腸菌に加えて、4-アミノ桂皮酸を生産させます。

結果

1. 生合成経路探索

原料をグルコース、生成物を4-アミノ桂皮酸として入力することで図1のような人工合成経路が出力されました。グルコースからコリスミ酸の既知合成経路と同一の経路が出力され、4−アミノフェニルアラニンを介して4-アミノ桂皮酸を合成する経路が出力されました。

2. 類似反応探索

結果1で見出した人工的な合成経路のうち、4-アミノフェニルアラニン→4-アミノ桂皮酸の類似反応を探索しました。

類似反応探索により、アミノ基を脱離し、二重結合を生成する反応が抽出されました。標的反応との反応類似度が高い類似反応の一部とその順位を図2に示しました。標的反応と完全に一致する反応を含む類似反応が抽出されました。

3. 類似反応該当酵素探索

結果2で標的反応の類似反応を抽出しました。この類似反応を担う酵素配列をtaxonごとに抽出しました。絞り込んだ配列と論文中で使用された酵素を比較しました。Rhodotorula属、Eukaryotaドメイン、全taxonの3段階で配列を抽出しました（表1）。抽出した配列には、論文で使用された配列と90%以上の配列相同性を示すものが含まれていました。

終わりに

本ブログでは人工的な合成経路の探索を実演しました。材料として高強度ポリマーの原材料となる化合物4-アミノ桂皮酸をグルコース  から合成する人工的な経路を探索しました。この経路のうち、4-アミノフェニルアラニンから4-アミノ桂皮酸を合成する酵素を類似反応酵素探索技術を用いて見つけることができるか試しました。上記の反応に対して、任意のtaxonごとに配列を抽出し、それぞれの配列数を示しました。実際に論文で使っていた酵素に非常に近い配列を含む複数の配列を抽出することができました。

謝辞

今回の合成経路探索には以下の論文のデータを利用させていただきました。

Tateyama et al., (2016) Ultrastrong, Transparent Polytruxillamides Derived from Microbial Photodimers. Maclomolecules.

はじめに

事業開発部の礒崎です。弊社では未知反応を担う酵素探索を行っています。既知酵素反応との反応類似度および既知反応を担う酵素配列との配列相同性を基にして、標的の未知反応を担う酵素配列候補を出力します。本ブログでは、その具体例としてエイズ治療薬候補の1つIslatravirという化合物の合成反応を実際に担う酵素配列を予測した結果をご紹介します。

酵素探索に使用した材料

Huffman et al., 2019のデータを使わせていただきました。この論文ではIslatravirの新規合成経路を設計し、経路中の反応それぞれを触媒する酵素を見つけ、その実証実験を行っていました。Islatravirの合成反応を図1に示しました。化合物6 → 化合物7 or 8 → 化合物5 → 化合物4 → 化合物3 + 化合物2 → Islatravirという順番に合成されます。この合成経路の各反応を担う酵素を弊社の酵素探索技術で予測し、論文で使用された酵素と比較しました。

結果

まずは、合成経路の5反応それぞれと類似する反応を探索しました。

1. 類似反応探索

出発物質6→8（または7→5）リン酸化反応の類似反応

水酸基をリン酸化する反応が類似反応として多く抽出されました。標的反応との反応類似度が高い類似反応の一部とその順位を図3に示しました。この反応は上記反応同様、既知の代謝反応にはないため複数候補の類似反応が抽出されました。

中間体5→4 のリボース合成反応

アセトアルデヒドを添加することで閉環してデオキシリボースとなる反応が抽出されました（図4）。論文中でこの反応は既知の代謝反応を模倣しているため、アルキニル基以外全く同じ反応が類似反応として得られました。

中間体4→3のリン酸基転移反応

リン酸基をヒドロキシアルキル基から水酸基へ転移する反応が抽出されました（図5）。上記リボース合成反応と同様にこの反応も既知の代謝反応を模倣しているため、アルキニル基以外全く同じ反応が類似反応として得られました。

中間体3→Islatravirのヌクレオシド合成反応

プリンをデオキシリボースに付加する反応が抽出されました（図6）。上記リン酸基転移反応と同様にこの反応も既知の代謝反応を模倣しているため、アルキニル基およびフッ素以外全く同じ反応が類似反応として得られました。

2. 類似反応該当酵素探索

結果1で5反応それぞれの類似反応を抽出しました。この類似反応を担う酵素配列をtaxonごとに抽出しました。絞り込んだ配列の中に論文中で使用された酵素が含まれたかを5反応それぞれで調べました。さらに、5反応それぞれにおいて、全taxon由来の酵素配列から系統的位置を用いたスクリーニングにより配列を絞り込みました。

類似反応のTaxonごとの酵素配列抽出

結果1の類似反応を担う酵素を探索し、Escherichia属、バクテリア、全taxon由来の3段階で抽出しました。抽出した配列数を以下の表1に示しました。今回の論文で使用している酵素と一致するものが含まれていたか調べました。5反応中4反応で、弊社酵素探索技術で抽出した酵素配列に論文中で使用された酵素が含まれていました。

系統的位置によるスクリーニング

全taxonより抽出した上記の類似反応酵素配列から、さらに系統的位置により配列を絞り込みます。全配列をクラスタリング・系統樹を生成、系統的にまとまった配列群から1配列ずつ選定しました。この選定の際、その配列の種間での保存度の高いものを優先して選定します（表2、図7）。

6→7（8→5）の酸化反応についての考察

上記結果にあるように、論文中でこの反応に使用された酵素は今回見つかりませんでした。その要因としては標的反応6→7（8→5）と論文中で使用した酵素反応がそれほど似ていないことにあると考えます（図8）。今回の類似反応探索で見つけた反応も論文中で使用されたO2を利用したOxidoreductaseであり、標的反応を触媒する可能性があると考えます。図9の反応を触媒する酵素として論文中ではUniParc ID: UPI0001E112C2を使用していると推定されます。これはRHEA_24161を触媒することが確認済みの配列のUniRef50のメンバーに含まれています。UPI0001E112C2自体はこの反応を触媒するかcurationされていません。

終わりに

本ブログでは、未知反応を担う酵素の探索を実演しました。材料として論文で触媒する酵素を見つけたIslatravirの新規合成経路を用いました。この経路の各反応を担う酵素を類似反応酵素探索技術を用いて見つけることができるか試しました。5つの未知反応に対して、実際に類似反応をそれぞれ複数抽出しました。この際、任意のtaxonごとに配列を抽出し、それぞれの配列数を示しました。4つの反応では実際に論文で使っていた酵素を含む複数の配列を抽出することができました。そして、系統的位置を加味したスクリーニングで、全taxonから抽出した類似反応酵素を絞り込みました。通常のスクリーニングではさらに、酵素自体の性質（細胞局在など）や3次元構造など他の指標も使って候補配列を絞り込めます。

謝辞

今回の類似反応酵素探索には以下の論文のデータを利用させていただきました。

Huffman et al., (2019) Design of an in vitro biocatalytic cascade for the manufacture of islatravir. Science.